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IL-3 雞白介素3酶聯免疫試劑盒分光光度法
點擊次數:699 更新時間:2022-07-20

  為了更好的使用elisa試劑盒,接下來為大家說一下elisa試劑盒的提純方法,希望以下介紹對大家有所幫助。

IL-3 雞白介素3酶聯免疫試劑盒分光光度法 注意:正式測定之前選擇2-3個預期差異大的樣本做預測定。 試劑一:液體×1瓶,4℃保存。 試劑二:粉劑×1瓶,4℃保存。臨用前加10mL蒸餾水溶解。 試劑三:粉劑×1瓶,4℃避光保存。臨用前加入10mL試劑一,沸水溶解。試劑四:粉劑×1瓶,4℃保存。臨用前加50mL蒸餾水溶解。試劑五:液體×1瓶,4℃保存。 標準品:液體×1支,0.25μmol/mL標準酪an酸溶液,4℃保存。自備儀器和用品: 可見分光光度計、水浴鍋、磁力攪拌器、可調式移液槍、1mL玻璃比色皿、1.5mLEP管和蒸餾水。產品說明: NP在一定的溫度和中性pH條件下,催化水解蛋白質。由于其安全無毒、水解能力強、作用范圍廣等特點,中性蛋bai酶常用于食品、飼料、化妝品和營養保健品。 中性條件下,NP催化酪蛋白水解產生酪an酸;在堿性條件下,酪an酸還原磷鉬酸化合物生成鎢藍;在680nm有特征吸收峰。

操作過程:

一、粗酶液提取:

1.組織:按照組織質量(g):試劑一體積(mL)為1:5~10的比例(建議稱取約0.1g組織,加入1mL試劑一)冰浴勻漿,8000g,4℃離心10min,取上清,即粗酶液。2.血清或培養液:直接測定。 3.細菌、真菌:按照細胞數量(104個):試劑一體積(mL)為500~1000:1的比例(建議500萬細胞加入1mL試劑一),冰浴超聲波破碎細胞(功率300w,超聲3秒,間隔7秒,總時間3min);然后8000g,4℃,離心10min,取上清置于冰上待測。

二、測定操作: 1.分光光度計預熱30min,調節波長到680nm,蒸餾水調零。2.試劑二、試劑三和試劑四置于30℃水浴保溫30min。 3.對照管:取一支EP管,加入100μL粗酶液,200μL試劑二,混勻后置于30℃水浴保溫10min;加入200μL試劑三,混勻后8000g,4℃離心10min;取200μL上清液,加入新的EP管,再加入1000μL試劑四,200μL試劑五,混勻后置于30℃水浴保溫20min,于680nm測定光吸收,記為A對照管。 4.測定管:取一支EP管,加入100μL粗酶液,200μL試劑三,混勻后置于30℃水浴保溫10min;加入200μL試劑二,混勻后8000g,4℃離心10min;取200μL上清液,加入新的EP管,再加入1000μL試劑四,200μL試劑五,混勻后置于30℃水浴保溫20min,于680nm測定光吸收,記為A測定管。(注意與空白管不同,先加試劑三,后加試劑二) 5.空白管:取EP管,加入200μL蒸餾水,1000μL試劑四,200μL試劑五,混勻后置于30℃水浴保溫20min,于680nm測定光吸收,記為A空白管。 6.標準管:取EP管,加入200μL標準品,1000μL試劑四,200μL試劑五,混勻后置于30℃水浴保溫20min,于680nm測定光吸收,記為A標準管。注意:空白管和標準管只需要測定一次。

NP酶活性計算:

(1)按蛋白濃度計算 NP活性單位(U)定義:30℃每毫克蛋白每分鐘水解產生1μmol酪an酸為一個酶活單位。NP活性(U/mgprot)=C標準品×△A測定÷△A標準×V1÷(Cpr×V2)÷T =0.125×△A測定÷△A標準÷Cpr 

(2)按樣本鮮重計算 NP活性單位(U)定義:30℃每克樣品每分鐘催化水解產生1μmol酪an酸為一個酶活單位。NP活性(U/g鮮重)=C標準品×△A測定÷△A標準×V1÷(W×V2÷V3)÷T =0.125×△A測定÷△A標準÷WC標準品:標準酪an酸溶液濃度,0.25μmol/mL;Cpr:粗酶液蛋白質濃度,mg/mL;W:樣品鮮重,g; V1:酶促反應總體積,0.1mL;V2:加入反應體系中粗酶液體積,20µL=2×10-2mL;V3:粗酶液總體積,1mL; T:催化反應時間,10min。 注意:若反應較弱,(A測定管-A對照管)差值較小,可適當延長反應時間(20-30min),即第一步水浴時間,最后計算酶活時對公式進行修改。


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