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免疫染色的注意問題
點(diǎn)擊次數(shù):1355 更新時間:2016-01-15

1.免疫染色可在細(xì)胞涂片或組織切片上進(jìn)行免疫染色。首先,標(biāo)記抗體與標(biāo)本中抗原反應(yīng)結(jié)合。其次,用PBS吸取未結(jié)合成分。zui后,直接觀察結(jié)果(免疫熒光直接法)或顯色后再用顯微鏡觀察(免疫酶直接法)。在此基礎(chǔ)上發(fā)展出間接法、多層法,雙標(biāo)記法等各種方法。在免疫染色中應(yīng)特別注意增強(qiáng)特異性染色,減少或消除非特異性染色。在各種免疫染色中都應(yīng)注意以下幾個問題:

(1)增強(qiáng)特異性染色方法

1)蛋白酶消化法:目的是暴露抗原,增加細(xì)胞和組織通透性,使抗原抗體zui大限度結(jié)合,增強(qiáng)特異性染色和避免非特異性染色。該法已廣泛用于各種免疫細(xì)胞化學(xué)染色。常用蛋白酶有、及等;酶消化時間和溫度因各種抗原對消化的敏感性不同,應(yīng)根據(jù)酶活性通過預(yù)實驗確定,消化時間還與組織固定的時間有關(guān),越陳舊固定組織所需時間越長,以37℃為宜。

2)適宜的抗體稀釋度:抗體濃度是免疫染色關(guān)鍵步驟。濃度過高,抗體分子多于抗原決定簇,可導(dǎo)致抗體結(jié)合減少,產(chǎn)生陰性結(jié)果。

3)溫育時間:一般抗體溫育時間為30~60min,必要時可4℃過夜。溫育溫度常用37℃,也可在室溫中進(jìn)行。37℃可增強(qiáng)抗原抗體反應(yīng),適用于多數(shù)抗原染色,但應(yīng)注意在濕盒中進(jìn)行,防止切片干燥而導(dǎo)致失敗。

4)多層染色法:對弱抗原可用直接法(雙層)、辣根過氧化物酶一抗過氧化物酶(PAP)和抗一(ABC)法(j層),四層或五層PAP法或ABC法,或PAP和ABC聯(lián)合染色法等,可很大程度提高敏感性,獲得良好結(jié)果。

5)其他增敏方法:如微波處理法、酪氨酰胺信號放大技術(shù)(tyramide signal smplmcation,TSA)增敏方法以及免疫PcR方法等。

(2)減少或消除非特異性染色的方法:組織中,非抗原抗體出現(xiàn)的陽性染色稱為非特異性背景染色,zui常見原因是蛋白吸附于高電荷的膠原和結(jié)締組織成分上。有效消除方法是在用*抗體前,加與制備*抗體相同的動物的非免疫血清(1:20~l:5),封閉組織上帶電基團(tuán)而除去與*抗體非特異性結(jié)合。必要時加入2%~5%牛血清白蛋白,可進(jìn)一步減少非特異性染色,作用時間為lO~20min。

(3)顯色反應(yīng)的控制:免疫酶染色應(yīng)注意:1)成色質(zhì)濃度和反應(yīng)時間。增加成色質(zhì)的量和(或)增加底物反應(yīng)時間,可增加反應(yīng)產(chǎn)物強(qiáng)度,著色太深可減少反應(yīng)時間。2)過氧化物酶顯色時,H2O2濃度較大將使顯色反應(yīng)過快而導(dǎo)致背景加深,過量H2O2可抑制酶活性。

(4)復(fù)染:根據(jù)所用實驗方法和呈現(xiàn)顏色不同,可選用適當(dāng)復(fù)染方法。如陽性結(jié)果呈紅色或棕色,則用蘇木素將細(xì)胞核染成藍(lán)色,以便定位檢測。

4.對照設(shè)對照目的在于tiEBIj陽性結(jié)果的特異性,排除非特異性結(jié)果。主要針對*抗體對照,常用對照方法包括:陽性對照、陰性對照、阻斷試驗、替代對照、空白對照、自身對照和吸收試驗。

5.免疫細(xì)胞化學(xué)結(jié)果判斷對免疫細(xì)胞化學(xué)結(jié)果判斷應(yīng)注意幾點(diǎn):①準(zhǔn)確判斷陽性和陰性,排除假陽性和假陰性結(jié)果,必須嚴(yán)格對照試驗,對新發(fā)現(xiàn)陽性結(jié)果,除有對照試驗結(jié)果之外,應(yīng)進(jìn)行多次重復(fù)試驗,并用幾種方法進(jìn)行驗證。②判定特異性染色和非特異性染色:特異性反應(yīng)產(chǎn)物常分布于特定部位,且在同一切片上呈現(xiàn)不同程度陽性染色結(jié)果。而非特異性染色表現(xiàn)為無一定的分布規(guī)律,常呈某一部位成片的均勻著色,細(xì)胞和周圍結(jié)締組織均無區(qū)別著色,或結(jié)締組織呈現(xiàn)很強(qiáng)的染色;常出現(xiàn)于干燥切片邊緣,有由于過強(qiáng)刀痕或自制折疊的部位;在過大組織塊,中心固定不好也會造成非特異染色。當(dāng)非特異性染色和特異性染色同時存在時,過強(qiáng)的非特異性染色背景會影響對特異性染色結(jié)果的觀察和記錄。

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