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錯配修復基因檢測細胞衰老
點擊次數:1323 更新時間:2016-08-08

錯配修復基因超家族屬于管家基因,目前已發現人類6個錯配修復基因:hMSH2、hMSH3、hMSH6、hMLH1、hPMS1和hPMS2。錯配修復基因的異常表現為基因突變和蛋白質表達的減步,而蛋白質表達涉及RNA水平和蛋白質水平。下面就RNA水平作一簡要闡述。

錯配修復基因mRNA原位雜交:

【材料】

蓋玻片、濕盒、雜交爐、PBS、SSC、預雜交液、BcIP/NBT。

【操作程序】

1.將細胞制成1~107/L細胞懸液,將細胞懸液一滴接種于已消毒培養皿中的蓋玻片上,加培養基培養48小時。

2.將細胞生長狀態良好的蓋玻片取出0.01mol/L PBS漂洗3次,甲醇:丙酮(1:1)固定液固定10分鐘,PBS漂洗3次。

3.將制好的細胞片用10mg/ml蛋白酶K消化,37℃,10分鐘,PBS洗2次,每次2分鐘。

4.取200μl預雜交液95℃變性10分鐘,冰浴中驟冷,加樣于細胞標本上.平放入密封濕盒.42℃孵育3小時。

5.標記探針加于200μl預雜交液中,95℃變性10分鐘,冰浴中驟冷,加樣于細胞標本上,平放入密封濕盒,42℃恒溫過夜。

6.依次用6 xSSC-45%甲酰胺洗10分鐘,2×SSC洗10分鐘×2次,0.2xSSC洗10分鐘×2次。

7.加堿性磷酸酶標記的抗體,37℃,4小時。

8.洗脫液洗10分鐘,加入BCIP/NBT顯色。鏡檢顯況,PBS沖洗,終止顯色。

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